„Glioblastoma in a dish“ – Die Etablierung eines Mausmodells für das sekundäre Glioblastom

Bei dem Glioblastoma multiforme handelt es sich um den häufigsten primären Hirntumor. Es handelt sich um einen sehr malignen Tumor, der Menschen in mittlerem Alter betrifft und sich durch eine infauste Prognose auszeichnet. Trotz einer Kombination aus Operation, Radiatio und verschiedenen Ansätzen der Chemotherapie, versterben die meisten Pateinten bereits im ersten Jahr nach Diagnosestellung. Es wird zwischen primären und sekundären Glioblastomen unterschieden. Das primäre Glioblastom entwickelt sich völlig neu (de novo). Es gibt weder radiologische, noch histologische Hinweise auf einen vorausgegangenen weniger malignen Tumor. Häufige Mutationen sind EGFR-Amplifikation, Deletion des p16INK4a und LOH (loss of heterozygosity) von 10q. Im Gegensatz dazu, entwickelt sich das sekundäre Gliobastom durch Progression eines niedriggradigen oder anaplastischen Astrozytoms. Bereits in den niedrigmalignen Vorläuferläsionen kommt es häufig zu einem Verlust des Tumorsuppressors p53. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 45 Jahren. Das Glioblastom ist bevorzugt in den Großhirnhemisphären, insbesondere frontotemporal, lokalisiert. Makroskopisch zeichnen sich diese Tumoren durch eine bunte Schnittfläche aus. Charakteristisch sind gelbliche Nekrosen, Blutungen, grau-weiß aussehendes Tumorgewebe und diffuses infiltrierendes Wachstum. Rein histologisch können beide Tumorentitäten nicht voneinander unterschieden werden. Um den Ursprung des Tumors und dessen Tumorbiologie sowie Infiltration und Migration besser verstehen zu können und um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, werden gute Mausmodelle benötigt. In der Vergangenheit gab es einige gute Ansätze zur Entwicklung eines solchen Modells. Leider gelang es keinem Modell das infitrative Wachstum im Gehirn nachzuempfinden, welches für die Läsion so charakterisch ist. Desweiteren gibt es Unstimmigkeiten in der wissenschaftlichen Gemeinschaft bezüglich der Ursprungszellen des Glioblastoms. Es konnte bisher nicht herausgefunden werden, ob es sich bei diesen Zellen um differenzierte Astroyzten oder aber neurale Progenitoren handelt. Holland et al. entwickelten ein vielversprechendes Glioblastom-Modell durch Gentransfer und eine daraus resultierende Überexpression von K-Ras uns Akt in neuralen Progenitoren. Des Weiteren publizierten Lassman et al. ein Modell mit differenzierten Astroyzten, die durch eine Überexpression von c-Myc einen undifferenzierten Phänotyp zeigten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Glioblastom-Modells mit differenzierten Astrozyten jedoch ohne eine Überexpression von K-Ras, da dieses eine für das Glioblastoma multiforme eher untypische Mutation darstellt. Diese Arbeit konzentrierte sich somit auf die Verwendung von p53-knockout Astrozyten. Diese wurden aus neugebornenen p53-knockout Mäusen gewonnen und kultiviert. Die kultivierten Astrozyten wurden mit einem Überstand von kultivierten und vorher transfizierten Phoenix-Zellen infiziert. Bei den Phoenix-Zellen handelt es sich um eine Zelllinie, die nach einer Transfektion mit bestimmten Plasmiden fähig ist, einen Retrovirus zu produzieren, der widerum für die Infektion anderer muriner Zellen zur Verfügung steht. Somit konnten in dieser Arbeit 3 verschiedene Zelllinien generiert werden: p53-knockout Astrozyten, die Akt, Myc oder Akt und Myc überexprimierten. Durch die Überexpression von Akt konnten die Zellen immortalisiert werden. Myc-überexprimierende Astrozyten zeigten ein rapides Zellwachstum und einen undifferenzierten Phänotyp. Verschiedene Passagen der Kulturen wurden immunhistochemisch gegen Ki67, GFAP und neurale Marker für Progenitoren wie Olig2, Nestin, Musashi-1 und CD133 gefärbt. Es kam zu einem Verlust des GFAP und einer positiven Immunhistochemie für die neuralen Marker der Progenitoren in späten Passagen. Mit Hilfe eines RNA Protection Assay (RPA) konnte auf RNA-Ebene bewiesen werden, dass es sich bei den Kulturen um reine Astrozytenkulturen handelt, die auch im Verlauf späterer Passagen keine neuronalen Marker, wie Synaptophysin, Calbindin oder Neurofilament exprimierten. Im Verlauf der Arbeit injizierten wir stereotaktisch Myc und Akt überxprimierende p53 knockout-Astrozyten (p53MA) in das rechte Striatum von Bl6- und RAG2-/- Mäusen. Nach 21 Tagen wurden die Hirne der Tiere entnommen und Kryostatschnitte angefertigt. Durch eine HE-Färbung konnte das Tumorwachstum nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden die Schnitte immunhistochemisch gegen CD4, CD8 und Mac-1 gefärbt. Es konnte keine Infiltration von Zellen des Immunsystems nachgewiesen werden